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比表面分析技术在2020中国药典中的应用
来源: | 作者:杨正红 | 发布时间: 2021-04-17 | 1753 次浏览 | 分享到:

比表面分析技术在2020中国药典中的应用

作者：杨正红  

理化联科（北京）仪器科技有限公司

药物粉体是大部分药物制剂的主体，其疗效不仅取决于药物的种类，而且很大程度上还取决于组成药剂的粉体性能，包括粒度、形状、表面特性等各类参数。药物粉体的比表面积和孔径关系到粉末颗粒的粒径、吸湿性、溶解度、溶出度和压实度等性能，而且最终影响到药物的生物利用度。国家药典委员会已颁布了最新的 2020 年版中国药典，增加了0991比表面积测定法，并已于2020 年12月30日起正式实施。用气体吸附法进行比表面和孔径分布测定，对于大多数制药行业的用户还比较陌生。作为毕业于药学院并从事气体吸附比表面和孔径分析 20 余年的科学工作者，有责任与大家分享一下我对0991的见解及气体吸附法测定比表面的最新技术发展。


一、中国药典2020版要求在相对压力 P/P0为0.05-0.3范围内至少进行3个压力点的测试，且BET方程相关系数需大于0.9975


1、有关BET比表面积的测量和计算：首先需要明确的是，BET 比表面积是通过多层吸附理论（BET 方程）计算出来的，而不是测出来的。我们需要测定的是液氮温度下的样品对氮气吸附的等温线，而发生多层吸附的区域多数是在P/P0：0.05-0.3的范围内，吸附曲线在这里进入平台区（图1）。BET 理论恰恰需要在这个阶段的吸附数据计算比表面积。完整的BET 报告必须包括比表面值、回归曲线、相关系数和C 常数（C 值，图2）。

2、有关BET 计算的P/P0 取点：众所周知，药典是制药行业的宪法，是基本法，也就是最低标准。0991的相关数据应该引自美国药典USP846，适用于介孔材料。但是，随着近些年纳米科技的发展和新型药品和药用材料的研发成功，已经开始应用多微孔的纳米载体材料控制药物缓释速度，而这些材料的多层吸附区域会前移，也就是可能到P/P0 为0.01~0.15的范围，这样药典中的取点范围就显得不合时宜了。因此，判断 BET 计算结果可靠性的标准应该是C 值大于0和回归系数大于0.9999。（延伸阅读：杨正红：《物理吸附 100 问》化工出版社，2016 年）


3、有关BET 方程相关系数：回归曲线的相关系数R=0.9975是对吸附等温线测定质量的过于粗放的低端要求，来源于20 年前的技术水平。由于比表面测定过程中有许多不可控因素，所以很难获得稳定重复的结果。因此，业内有“BET 差5%不算差”的说法，由此，按允许偏差±5 计算：R = （1+0.0500）x （1-0.0500）= 0.997500由于BET 的计算是取自多层吸附已经完成，孔中的毛细管凝聚尚未发生的平缓线性阶段数据，这显然是一个到达极限的最低标准。以这么低的标准去进行比表面测定的质量控制，实际上等于没有控制。目前所有的全自动物理吸附分析仪都标榜重复性偏差不超过±2，这意味着：R =（1+0.0200）x （1-0.0200）= 0.999600也就是说，R 值不应该低于0.9996。如果按常规质检要求，重复性允许偏差±1 计算，则对R 值的最低要求为：R = （1+0.0100）x （1-0.0100）= 0.999900即回归曲线的相关系数不小于四个9（R > 0.9999）。


二、表征超低比表面积的技术突破
 

由于真空体积法气体吸附分析仪等温线测定依据的是理想气体方程，影响结果的主要因素不外乎温度、压力和体积。当样品的吸附量远大于这些因素引起的误差时，温度、压力和体积的波动或精度误差（仪器的本底噪音）可以被忽略不计，但是当药品这样的小表面材料所能吸附样品总量不足以克服本底噪音时，就带来了测试结果的不稳定性，甚至测不出来。为了解决超低比表面材料的质量控制的痛点问题，我们专门开发设计了iPore 400，该仪器从影响比表面测定的因素入手，严格控制由温度、体积和压力测量带来的误差，采用了一系列新技术，配合全自动智能脱气站，建立了新一代物理吸附仪的技术标准（图3）。它包括：


（1）全域自动恒温系统：拥有双路进气预热管路及包括 12 个静音风扇组成的高精度恒温系统（图 4），可根据需要在 35-50℃之间设定恒定温度。系统实时显示全区域气路和歧管的温度，避免环境因素带来的误差。


a) 内部整体恒温，可在 35-50℃之间设置：真空体积法是通过压力传感器读取压力的变化而计算吸附量的，其准确性和有效精度对温度变化极其敏感，尤其在微孔和超低比表面分析中


b) 0.02℃温控精度：三个温度传感器，实时显示各区域温度。高精度和高稳定的全恒温控制，可将压力变化控制在 0.05%以内，远小于传感器本身的不确定度（0.1%），可彻底避免因环境温度变化造成的分析误差。可根据地区需要和数据对比需要调节恒定温度.。

c) 进气预热恒温：由于涉及安全管理问题，大多数实验室气瓶置于室外，造成吸附气进气温度与室温或仪器内温差距巨大，定量注气失准。该系统消灭了地区差别和早晚温差对钢瓶气造成的误差，尤其为锂电材料，药物材料，膜材料的等小比表面质量控制带来福音。


d) 新型电磁阀：常规电磁阀的发热问题由来已久，严重影响气体定量和压力读数的准确性，该问题在超低比表面和微孔分析时尤为突出。为解决这一问题所开发的带有自锁功能的电磁阀，无需持续供电便可保持开启或关闭状态，发热量等效为零，消除了电磁阀工作中发热引起的测量误差，极大地提升了分析性能。


（2）压敏死体积恒定技术：通过压力传感器和伺服反馈电梯精确控制液氮液位，保持过程中死体积恒定。【专利号：ZL 2019 885784.5】真空体积法物理吸附是在一个密闭空间进行的。自由空间是系统中吸附质分子传递、扩散的区域，如果要精确计算样品的物理吸附量，死体积值是准确采集数据的基础。因为真空体积法的测量基础是压力，吸附量的计算基础是理想气体状态方程，所以吸附质气体在扩散过程中压力差越大，则气体绝对量计算越准确。系统死体积越小，对压力变化的灵敏度越高，吸附量计算越准确。换句话说，在同样的条件下，系统死体积越小，则仪器测量精度越高。由于在氮吸附分析过程中，液氮是不断挥发的，所以为保证精确计算吸附量，要对死体积进行控制、测量或校准。


（3）32 位芯片及电路系统：采用全新 32 位芯片及电路系统，相比 24 位系统，压力传感器分析精度提升30 倍以上，确保超低比表面测量的极致精度。模数转换器即 A/D 转换器，简称 ADC，它是把连续的模拟信号转变为离散的数字信号的器件。转换精度就是分辨率的大小，因此要获得高精度的模/数转换结果，首先要保证选择有足够分辨率的ADC，同时还必须与外接电路的配置匹配有关。iPore 系列不仅采用32 位模数转换，而且采用拥有自主知识产权的 32 位电路设计和制造，从系统上保证了压力传感器精度的进一步提升（见表1）。

这些新技术的采用，带来了意想不到的突破。它不仅可以用氮吸附测定 0.005 m2/g 左右的比表面积，大大超越了常规氮吸附的比表面下限极值（0.01m2/g），而且可以测得微量吸附下的孔径分布（图6）。




表2 超低比表面标准品比表面长期稳定性实验



三、突破性吸附技术对制药行业的应用意义 


1. 超低比表面样品测定的重复性、重现性和稳定性：仪器的长期稳定性是低比表面材料样品质量检测和质量控制的基础保证。为了验证新技术的准确性和长期稳定性，使用氮气测试比表面标准样品(标称值0.221±0.013m2/g，氪吸附)的重复性偏差（表2）。结果表明，iPore 400 的即时重复性偏差优于0.1%，一天重复性偏差优于0.6%，四天长期稳定性优于 1.0%！性能的全面优化使 BET 比表面测定长期重复性达到空前水平！iPore 400 可以配置6 个独立的分析站（图 4），具有极高的通量，不仅节省分析时间，提高了分析效率，而且6 个站BET 测定结果具有高度的一致性，重现性偏差同样优于1%（表3）。


2. 超高比表面样品测定的重复性：共价有机框架聚合物（COF）是一种低密度、高比表面、易于修饰改性和功能化的新型人工合成材料。在问世的短短十余年之间，就在气体储存与分离、非均相催化、储能材料、光电、传感以及药物传递等领域展现出优异的应用前景，并且已经发展成为一种纳米药物载体。常规气体吸附法比表面容易测定的范围是5~500 m2/g 之间。因为吸附量巨大，需要长时间的平衡条件，比表面大于 1000 m2/g 的样品重复性控制并不容易做到。为此，对比表面大于2000m2/g 的COF 样品比表面进行了长期稳定性测定，结果重复性优于0.07%（图 8）！



3. 能力验证——新技术对超低比表面样品测定重复性的重要性：为了比较新技术和现有技术在超低比表面应用中的区别，我们用一种极低比表面的金属氧化物对仪器性能进一步进行了验证，并与其它品牌的测试结果进行了比较（图8）。结果表明，新技术不仅两次测定（图8a 和 b）相关系数都在 0.9999 以上，而且 BET 比表面和吸脱附等温线都能很好地重复；而一旦关闭死体积恒定功能，虽然 BET =0 .032 并且相关系数（R=0.9987）依然满足药典 0991 要求（图8c），但其数据质量已经迅速下降，脱附等温线已经发生变形，说明这些采用的新技术相辅相成，缺一不可。而没有这些技术的常规氮吸附分析仪器的噪音已经完全掩盖了该样品的微弱吸附量，无法分辨（图8d）。




a 和 b：iPore 400 两次测定的结果，比表面积值可以完全重复；c:：iPore 400 关闭死体积恒定功能的结果，可见 BET回归系数下降，脱附曲线受液氮挥发导致的死体积变化，已经完全变形 ；d：其它品牌仪器所测的结果，吸附量被仪器本身的噪声所掩盖，等温线显示为仪器本底的随机噪声曲线


4. 在标准“介孔仪器”配置上实现氪吸附：药品多为有机化合物，比表面值一般都很低。新版中国药典0991 指出，对于比表面积小于0.2m2/g 的供试品，为避免测定误差，可选用氪气作为吸附质；也可选用氮气作为吸附质，但必须通过增加取样量，使供试品总表面积至少达到 1m2 方可补偿测定误差。氪气（Kr）因其在液氮温度下的饱和蒸汽压特性，是用于小比表面积样品的精密测试方法。但是，进行Kr 吸附一般至少需要配备10 torr 的高精密压力传感器以及分子泵，以分辨 P/P0 在10-5~10-4的极低压力环境下细微的压力变化，从而保证数据精确且稳定。氪吸附应用到小于0.05 m2的绝对表面积计算。但是，一般的氪吸附的应用需要配置分子泵和10torr 压力传感器，这给企业带来了额外的成本负担。而新技术的突破可以在标准配置（机械泵和1000torr 压力传感器）的条件下满足氪吸附的应用要求，P/P0 下限达到可重复的 10-5（图 9），为医药企业节约了检测投资成本！


图 9 iPore 400 全自动物理吸附分析仪 COF 测定的等温吸附曲线，在机械泵条件下，P/P0下限可到 10-5，并且可完全重复测定！


5. 用氮吸附完全替代氪吸附：其实，在77.4K 的氪吸附实际还存在着许多问题，如其吸附层的性质和热力学状态并不明确，是固体还是液体？应该参照何种状态来计算 P/P0？与此连带的一些问题是，在远远低于三相点温度的环境下，氪作为被吸附相有怎样的浸润特性（因为在BET 方法中，假设吸附质相完全浸润）？在 77K 的氮吸附中，可以观察到几乎所有材料都被完全浸润的特性，但在低于三相点温度时，这种情况可能是不同的。另一个不确定因素是氪分子的有效横截面积，它非常依赖于吸附剂表面，因此没有被很好地建立起来。从氪的过冷液体密度计算出的横截面面积是 0.152 nm2 (15.2 Å2），但通常会用较大的横截面面积值，甚至高达0.236 nm2（23.6 Å2）。采用较多的横截面积值是 0.202 nm2（20.2 Å2）。除此之外，氪气的成本是氮气的240 倍，这意味着氪吸附测定需要高昂的实验成本，会极大加重企业负担。因此，理化联科气体吸附分析技术上的突破带来了药企行业应用的巨大突破，氮吸附已经成功地实现了氪吸附领域的超低比表面积测定（图 6~8）。我们用氮吸附成功测定的极限样品是0.0047m2/g，这意味着只有当试样比表面小于0.005m2/g 时，才需要氪吸附，而这样的样品凤毛麟角。也就是说，一台全部采用上述新技术的仪器可以全部满足药企各种比表面的测定需求。


6. 建立超滤膜孔径（纳米孔）评价的新方法：滤膜孔径评价的经典方法是气体渗透法（即毛细管流动法），但这种方法的适用范围是 20nm~500μm。超滤膜是一种孔径范围为1-20nm 的纳米孔过滤膜，其范围恰恰在气体渗透法能力之外。该膜的孔径范围虽然被气体吸附法所覆盖，但由于膜的吸附量过低，常规的气体吸附法无法实现测定。国外曾经建立起了液氩温度下氪吸附测量膜孔径的方法，但无论仪器、耗材及方法都很难向工厂推广。制药行业中膜技术应用存在的技术瓶颈亟待解决，需要建立快速可行的超滤膜孔径评价方法。实际上，电池隔膜和电子薄膜也存在类似问题。气体吸附技术在精度控制上的突破也为纳米薄膜的孔径分布分析带来佳音，这种吸附量极低的孔径分析不再需要液氩温度下的氪吸附，只需要按照常规操作即可（图 6 右）。


7. 突破传统“介孔仪器”，实现微介孔样品的氮吸附微孔测定：新的气体吸附技术标准使 1000torr 传感器的分辨率提高到了 10torr 级别，仪器的密封性使机械泵抽空效率发挥到极致。以氮吸附替代氪吸附，以传统介孔仪器成功测定微孔（图 10），不仅节约了用户购买仪器的成本，而且降低了用户使用成本；不仅将比表面测定的重复性提高一个数量级，而且微孔分析的重复性也得到充分保障，对 MOF/COF 样品的研究开发将起到推动作用。


8. 气凝胶较大介孔和边际大孔的孔径分析取得突破：
气体吸附法介孔孔径分析的经典方法是 BJH法，它是基于以毛细管凝聚理论为基础的KELVIN公式。其基本概念是，当压力增加时，气体先在小孔中凝结, 然后才是大孔。因此，孔径与压力有对应关系。但是，当孔径大于10nm 以后（对应 P/P0=0.90），压力上升0.05（P/P0=0.95），对应的孔径已经是20nm 了，并且呈指数上升。如：P/P0=0.98 对应 50nm，而0.99则已经是100nm 了。因此，虽然ISO15901-2指出气体吸附法的孔径测定上限是100nm，但实际上很少有人能做到30nm以上去，因为压力传感器必须能够密集分辨和探知百万分之一的压力变化，这大大超出了常规压力传感器0.15%分辨率的标称值。气凝胶是一种新型低密度多孔纳米材料，具有独特的纳米级多孔及三维网络结构，同时具有极低的密度（3­500kg/m3）、高比表面积（200­1000m2/g）和高孔隙率（孔隙率高达 80­99.8％，孔径典型尺寸为1­100nm），从而表现出独特的光学、热学、声学及电学性能，具有广阔的应用前景。在医药领域，气凝胶被用于药物可 控释放体系。但是，其孔径分布分析却遇到麻烦，因为压汞仪的高压会破环样品的孔结构。致病微生物在多孔氧化铝膜上生长不易受到限制，因此氧化铝膜常用于药物敏感性实验（DST）了解病原微生物对各种抗生素的敏感程度或耐受程度来指导临床用药。与气凝胶相反，膜的单位吸附量极低，但孔径可能达到100nm 以上。由表1 可知，32 位电路新技术可以极大地提高压力传感器的分辨率，至少可分辨 3.9 x 10-8的相对压力变化，因此，我们尝试对气凝胶和氧化铝膜进行孔径分布分析。利用精细投气控制新技术，0.99 以上的设点间隔达到0.0002 的密度，最高吸附点达到了0.9980（对应孔径 559nm），在测试方法上取得新的突破，为建立气凝胶和氧化铝膜孔径分析的新方法奠定了坚实的基础（图 11）。


四、总结

工欲善其事，必先利其器!利用气体吸附分析仪进行比表面积质量控制分析时，经常碰到如下问题：不同厂家仪器之间数据不一致；同一型号在不同地域或不同海拔的数据不一致；同一台仪器在白天晚上或春夏秋冬的数据不一致；同一台仪器长期稳定性不好。这些现象已经成为长期困扰行业质量控制的头疼问题。气体吸附分析技术的突破不仅彻底攻克了这个难题，而且使超低比表面分析达到高稳定性、高重复性、高效率；随之产生的功能性扩展，无论用氮吸附代替氪吸附，还是孔径分布测定向介孔两端范围延伸拓展，都为中国企业全面贯彻中国药典0991带来了超高性价比的惊喜！